Nous nous intéressons aux premières étapes de l'infection impliquant les interactions des pathogènes avec la membrane. La membrane plasmique est hétérogène et parmi les domaines membranaires qui la composent, des microdomaines spécialisés appelés radeaux lipidiques semblent jouer un rôle important dans de nombreux processus physiologiques et dans des désordres pathologiques. Nous examinons le rôle de ces domaines lors de l'étape d'adhésion à la membrane plasmique. Consécutivement à l'internalisation des pathogènes invasifs, ces domaines membranaires jouent un rôle important que nous étudions également. En utilisant une approche interdisciplinaire alliant génétique bactérienne, biologie cellulaire et moléculaire, biochimie des membranes et biophysique, nous voulons identifier des cibles pour le développement de nouveaux outils thérapeutiques.
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Frank Lafont |
Biologie cellulaire et moléculaire des interactions hôte-pathogène
L'hypothèse des radeaux lipidiques, enrichis en cholestérol et sphingolipides, constitue un des thèmes les plus discutés dans le domaine de la biologie cellulaire (Ikonen et Simons, Nature, 1997). La description de ces radeaux lipidiques a profondément modifié l'étude de la compartimentalisation à la membrane plasmique de machineries moléculaires impliquées dans les interactions entre pathogènes et cellule hôte.
Après avoir participé à l'émergence du concept de radeaux lipidiques en étudiant plusieurs complexes moléculaires impliqués dans le trafic membranaire, nous avons proposé que l'ubiquitylation pouvait participer aux mécanismes de régulation de la dynamique d'assemblage et de désorganisation des radeaux (Lafont et Simons, PNAS 2001).
A partir de 2000, à l'Université de Genève avec FG van der Goot (Centre Médical Universitaire) et en collaboration avec P. Sansonetti (Institut Pasteur, Paris), nous avons initié un projet de recherche visant à disséquer les voies de signalisation activées dans les radeaux et impliquées dans les étapes précoces de l'infection. Comme modèle d'étude, nous utilisons Shigella flexneri, l'agent de la dysenterie humaine bacillaire (Cossart et Sansonetti, Science, 2004). Nous avons identifié une molécule d'origine bactérienne et un récepteur de surface qui partitionnent dans ces microdomaines lors de l'infection et démontré que l'invasion dépendait de l'intégrité des radeaux (Lafont et al., EMBO J, 2002). Par ailleurs, nous avons montré que ces microdomaines étaient capables d'induire la sécrétion d'effecteurs bactériens dans la membrane cible et que certains de ces effecteurs s'associaient préférentiellement aux radeaux (van der Goot et al., J. Biol. Chem. 2004).
En collaboration avec plusieurs groupes de l'Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne, nous avons récemment développé pour l'étude des interactions hôte-pathogène une nouvelle approche qui est basée sur l'utilisation des nanotechnologies. Nous avons utilisé la microscopie à force atomique dans le but d'étudier en temps réel la dynamique de l'élasticité de la membrane plasmique interagissant avec une toxine bactérienne sur cellules vivantes (neurones hippocampaux en culture primaire ; Roduit et al., soumis). Nous avons analysé les courbes force-distance entre les molécules de surface ancrées à la membrane par un groupe glycosylphosphatidyl inositol (GPI) et l'aerolysine, une toxine bactérienne, fixée sur le levier. Nous avons déterminé les changements de dureté de la membrane au niveau et à quelques nanomètres du point de contact et démontré que les radeaux formaient des plates-formes rigides à la surface cellulaire.
Par ailleurs, nous avons appliqué cette méthodologie à l'étude de l'internalisation des récepteurs de type AMPA après stimulation des récepteurs de type NMDA sur les neurones de l'hippocampe en culture primaire (Yersin et al. Biophys. J. 2007). Nous avons montré que cette internalisation affectait une sous-population de récepteurs située dans des domaines membranaires aux propriétés élastiques particulières.
Nous voulons poursuivre et développer le projet Shigella flexneri en identifiant par des moyens biochimiques les molécules de signalisation qui s'associent aux radeaux lipidiques et qui sont impliquées dans l'entrée de l'agent pathogène. La distribution de ces molécules sera examinée après étiquetage avec un marqueur fluorescent et analyse en vidéo-microscopie. Nous voulons également utiliser la microscopie en mode FRET afin de visualiser l'assemblage des molécules de signalisation au niveau des radeaux. (Nicolas Dupont).
Nous voulons appliquer l'analyse en microscopie à force atomique à d'autres systèmes, notamment avec l'endotoxine ou lipopolysaccharide (LPS) de Shigella et Brucella, des protéines de l'appareil du système de sécrétion de type 3 de Shigella, et les internalines de Listeria. Un des enjeux de ce projet et de suivre simultanément et en direct les propriétés mécaniques de la membrane et le recrutement des molécules de signalisation identifiées par l'approche décrite plus haut. (Sébastien Janel).
Nous développons cette approche interdisciplinaire alliant génétique bactérienne, microbiologie, biologie cellulaire, biochimie et biophysique à l'étude des étapes précoces de l'infection sur d'autres modèles expérimentaux. Ceci pour mieux appréhender les mécanismes infectieux impliquant des pathogènes responsables de pathologies représentant un énorme enjeu de santé publique : tuberculose, bactéries entéro-invasives, listériose, coqueluche et peste. Cette dernière constituant en plus un enjeu important relatif au problème du bioterrorisme. Nous voulons en particulier comprendre le mécanisme d'invasion de Mycobacterium tuberculosis dans les cellules épithéliales et en particulier les voies intracellulaires impliquées. (Sandra Lacas-Gervais). La même question est également abordée pour Bordetella pertussis, l'agent de la coqueluche. (Julie Bertout, Sandra Lacas-Gervais).
La microbiologie cellulaire de Yersinia pseudotuberculosis et de Yersinia pestis demeure encore peu étudiée et nous voulons là encore identifier les voies d'entrée afin de mieux comprendre comment ces bactéries usurpent les mécanismes cellulaires à leur propre avantage. (Kevin Moreau).
Un autre projet a pour but la détermination du profil d'expression de toutes les protéines à ancre GPI dans une cellule dans un état physiologique donné et en fonction du stade de développement. De nombreux pathogènes utilisent ces protéines comme site de liaison. Nous espérons ainsi identifier de nouveaux récepteurs et définir les fenêtres temporelles de susceptibilité à l'infection. (Julie Bertout). Cette approche présente un intérêt plus général dans la mesure où des protéines à ancre GPI ont une expression très finement régulée dans des processus cancéreux et d'inflammation. Une telle stratégie peut ainsi amener à l'établissement de tests diagnostics.
Ces études de différents modèles expérimentaux permettront de valider les approches et techniques développées dans le cadre de ce projet et surtout de disséquer les différentes voies initiées dans les radeaux lors de l'interaction hôte-pathogène. Il est important de souligner que de nombreux mécanismes cellulaires d'activation des voies de transduction dépendent de complexes moléculaires recrutés dans les radeaux que ce soit dans des mécanismes d'oncogenèse, lors de réactions immunes et dans certaines maladies neurodégénératives. Ainsi les possibilités d'interaction sont-elles nombreuses avec des équipes du campus qui s'intéressent à ces aspects. Les possibilités de développer des synergies avec les microbiologistes de la pathogenèse bactérienne et virale et aussi dans une optique transversale et interdisciplinaire apparaissent dès lors très prometteuses. Nous sommes convaincu que seule une approche visant à une synergie de compétences de chercheurs ayant une expertise dans différents domaines peut permettre de résoudre les défis originaux et ambitieux que nous nous sommes fixés. C'est pourquoi nous avons de nombreuses collaborations avec des groupes locaux, nationaux et internationaux. |
