Evaluation du risque mutagène et cancérogène pour l'homme et l'environnement
Le test des comètes in vivo comme outil dans l'évaluation du risque de la cancérogenèse rénale
Le test des comètes a fait l’objet d’un grand nombre de développements ces dernières années et a démontré sa sensibilité. Nous voulions dans cette étude déterminer la spécificité de ce test en recherchant parmi des cancérogènes rénaux et des agents néphrotoxiques, si seuls les cancérogènes agissant par un mécanisme génotoxique répondaient positivement dans ce test.
Le test mis en œuvre est le test des comètes ou Single Cell Gel Electrophoresis (SCGE). En utilisant une technique électrophorétique, ce test met en évidence des cassures d’ADN simple ou double brin sur des cellules individualisées. Il s’agit d’un test rapide, simple et sensible, permettant de visualiser les altérations de l’ADN directement au niveau de chaque cellule analysée et applicable à pratiquement tous les types de cellules eucaryotes. Le test des comètes est, parmi les diverses techniques existantes, l’une des mieux adaptées pour visualiser les altérations primaires de l’ADN. Une méthode permettant d’isoler les cellules rénales a été mise au point et 5 agents néphrocancérogènes génotoxiques (streptozotocine, orthonitroanisole, bromate de potassium, acides aristolochiques et cisplatine) administrées chez le rat ont répondu positivement dans ce test. Le cisplatine qui provoque des pontages interbrins a, à l’inverse des autres agents génotoxiques, démontré que son effet se caractérisait par une inhibition de la migration des fragments d’ADN, ce qui a pu être amplifié en modifiant les paramètres de migrations électrophorétiques. D’autre part, 2 agents néphrotoxiques (la streptomycine et l’indométhacine) ainsi que 2 cancérogènes épigénétiques rénaux chez le rongeur (le D-limonène et la ciclosporine) se sont avérés négatifs dans ce test ce qui démontre bien la spécificité de ce test et rend légitime son emploi dans l’étude des mécanismes d’action impliqués dans la cancérogenèse chez le rongeur.
Etude de la potentialisation et de l'antagonisme des effets génotoxiques de polluants atmosphériques au niveau pulmonaire
L’objectif du projet a été d’évaluer les effets génotoxiques induits chez le rat, dans différents types cellulaires d’origine pulmonaire, par l’exposition à des polluants atmosphériques de natures diverses : co-exposition à un composé organique aromatique et à un métal, exposition à des poussières seules, co-exposition à des poussières et à un composé organique aromatique.
Le critère du choix des produits chimiques étudiés dans ce volet génotoxicité du projet est essentiellement leur présence significative dans les atmosphères industrielles de la région Nord - Pas-de-Calais. Ainsi, nous nous intéresserons :
- aux poussières prélevées dans l’atmosphère de l’agglomération urbaine de Dunkerque,
- aux chloronitrobenzènes (CNBs), aux nitrotoluènes (NT), et au styrène pour ce qui est des composés organiques aromatiques.
- aux oxydes de fer (hématite), d’aluminium et de manganèse pour ce qui est des métaux.
Les études ont été réalisées in vitro : les poumons (cible privilégiée des polluants atmosphériques) ont été prélevés et soumis aux protocoles d’isolement : les macrophages alvéolaires ont été récupérés par lavage broncho-alvéolaire, alors qu’une suspension de cellules pulmonaires a été obtenue par digestion enzymatique du tissu. Les cellules pulmonaires et les macrophages alvéolaires ont été mis en culture (primo-culture) pendant 3h dans un milieu contenant l’un (ou un mélange de deux) des polluants atmosphériques sélectionnés.
Les COVs, styrène, 2-,3- et 4-CNB, 2-,3- et 4-NT, n’ont pas montré de potentiel génotoxique direct par le test des comètes sur macrophages alvéolaires.
Le 3-CNB et le 2-NT sont génotoxiques sur les pneumocytes, démontrant une génotoxicité isomère-spécifique.
Les oxydes métalliques, hématite et MnO2, ont induit des cassures au niveau des macrophages alvéolaires, peut-être liées à leur forte capacité de phagocytose, et la formation possible d’espèces réactives de l’oxygène.
Le 2-NT et le 3-NT diminuent la génotoxicité de l’hématite (scavenger) au niveau des macrophages alvéolaires. Le 3-NT diminue également la génotoxicité du MnO2.
Tests de mutagenèse comme outils dans l'évaluation du danger associé aux sols pollués
Les objectifs du projet sont de mettre en oeuvre des tests de génotoxicité in vitro et in vivo sur des sols d'origines différentes et de niveaux de pollution divers afin d'évaluer le niveau "normal" du potientiel mutagène de sols a priori non pollués en zones urbaines et rurales, de déterminer le potentiel génotoxique des sols pollués sur des systèmes biologiques, d'évaluer la biodisponibilité des contaminants du sol pour des organismes de mammifères, et d'évaluer globalement le danger associé à un sol pollué.
Les tests de génotoxicité in vitro ne pouvant pas être mis en oeuvre directement sur les sols à l'état solide, il faut recourir à une étape préalable d'extraction des polluants. L'optimisation des paramètres d'extraction a permis de retenir une extraction à 37°C pendant 24 heures utilisant un mélange dichlorométhane/acétone (v/v) selon un rapport masse de sol/volume de solvant de 1:10.
Une étude portant sur des extraits de sols provenant de zones urbaines, semi-urbaines, agricoles, ou naturelles a mis en évidence que tous les sols urbains restés induisent une activité mutagène significative, alors qu'aucun des sols d'origine naturelle étudiés n'induisent une activité mutagène décelable dans le test d'Ames. Ce travail a démontré que le potentiel mutagène d'un sol est fortement corrélé à l'activité humaine, mais pas à sa teneur en hydrocarbures aromatiques polycycliques.
Etude collaborative internationale sur le test in vitro du micronucleus
Le test in vitro du micronucleus ne fait pas encore partie des tests utilisés pour l’évaluation du risque mutagène du fait d’un manque de standardisation du test. Afin de pallier cette déficience, la Société Française de Toxicologie Génétique (SFTG) a organisé une étude internationale de validation mettant en œuvre 4 types cellulaires et des produits codés afin de déterminer les conditions optimales de réalisation de ce type de test. Le laboratoire de toxicologie de l’Institut Pasteur de Lille a participé à cette étude en tant que laboratoire participant, mais également en tant qu’organisateur de cette étude.
L’étude internationale a concerné 38 laboratoires dans le monde appartenant à 10 pays (France, Allemagne, Grande Bretagne, Pays Bas, Italie, Suisse, Belgique, Etats-Unis, Japon, Mexique). Le comité organisateur a adressé sous forme codé des produits positifs (aneugènes et clastogènes) et négatifs avec différents protocoles concernant le type de traitement et de récolte des cellules à réaliser. Quatre types cellulaires ont été étudiés : lymphocytes humains, CHO, CHL et L5178Y. Chaque produit a été étudié avec au moins 3 protocoles, dans au moins 2 laboratoires différents et étudié au moins 2 fois par chaque laboratoire.
Cette étude a permis de mettre en évidence que l’ensemble des lignées cellulaires pouvaient être utilisées pour cette étude et que différents temps de traitement et de recouvrement étaient nécessaires selon les produits pour obtenir une réponse optimale. L’intérêt ou non de la cytochalasine B a pu être démontrée en fonction des types cellulaires utilisés. La répétabilité et la reproductibilité des essais ont pu être estimées. Les résultats de cette étude constituent une importante base de données pour l’établissement d’une ligne directrice de l’OCDE pour ce test. |
